探秘煙草基因組·煙草全基因組基因芯片制作

基因研究“芯”力量

7月3日，鄭州煙草研究院，國家煙草基因研究中心（以下簡稱“基因研究中心”）。

靜靜的實驗室里，科研人員手持塑料水槍形狀的工具，從一個透明的塑料管里抽出些許溶液，小心翼翼地注入一個黑色的磁盤卡片。

“這個黑色的小卡片就是我們研究制作的煙草全基因組基因芯片。”基因研究中心分子生物學實驗室主任楊軍向記者介紹，當前他們正在做的是紅花大金元品種的基因表達譜研究。

隨著煙草基因組計劃重大專項的啟動實施，行業對煙草基因的研究愈加深入，先后繪制完成了栽培煙草、絨毛狀煙草、林煙草全基因組序列圖譜及物理圖譜。面對海量的基因序列數據，如何構建一種高效檢測、分析煙草基因的工具十分緊迫。

這個工具就是基因芯片。

所謂基因芯片，就是通過微加工技術，將數以百萬計特定序列的DNA片段，有規律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，構成一個二維的DNA探針陣列。這與計算機的電子芯片十分相似，所以被稱為基因芯片。

作為一種高通量分析全基因組基因表達譜的工具，基因芯片可用于研究煙草不同生長發育時期組織和器官的基因表達模式，進而鑒定出與煙草生長、抗性、品質等關鍵性狀相關的關鍵基因，是發現基因、研究基因的重要手段。

2012年1月，作為重大專項項目，“煙草全基因組基因表達圖譜構建和分析”項目正式啟動。以楊軍為負責人、基因研究中心及行業內科研機構相關研究人員組成的項目組開始了對煙草全基因組基因芯片的探索研究。

“煙草有7萬多個基因，通過基因芯片可以一次性檢測所有基因以及它們的活動規律，哪些是高表達的、哪些是不表達的等。這可以讓科研人員縮小篩選范圍，鎖定要尋找的目標基因。”楊軍打了個比方，“就像行軍地圖之于指揮員，通過基因芯片檢測分析所得到的基因表達譜也像一張地圖，能幫助科研人員準確鎖定目標的大致方位。”

小小的一個芯片，儲存著巨大的能量，也是推動行業深入開展基因研究不可或缺的工具。然而，研制基因芯片的道路并不平坦。

“在林煙草和絨毛狀煙草7萬多個基因中，有1萬多個屬于高度同源基因，就像孿生兄弟一樣十分相像，常規的表達譜芯片探針設計難以有效區分鑒別。如何準確界定這些基因，把它們的活動規律表達出來，是我們面臨的一大難題。”楊軍告訴記者，為破解這一難題，項目組與美國一家公司合作，進行了大量深入的分析研究，共同確定了覆瓦式探針設計思路，專門針對基因的差異位點設計探針，進而有效區分各個高度同源基因。

尋找----確認----驗證，科研的征程中沒有捷徑可走，也來不得半點含糊，他們必須反復確認、驗證，確保每一個基因的探針設計準確無誤。

2012年年底，經過科研人員近一年的努力，基因芯片制作完成，這是全球第一套煙草全基因組基因芯片。該款芯片覆蓋了36728個林煙草和絨毛狀煙草高度同源基因、38406個林煙草和絨毛狀煙草非高度同源基因、18966個栽培煙草基因，煙草基因探針集總數為2190855個，基因覆蓋度和芯片質量均處于國際領先水平，并且中國煙草對該款芯片擁有完全的知識產權。

對項目組而言，基因芯片的研制成功僅僅是一個開始。“這個芯片做的只是自然環境下典型產區的基因表達譜，下一步我們還要做理想環境下的基因標準表達譜，還有病害、低溫、干旱等脅迫條件下的基因表達譜。”楊軍說，這樣的基因表達圖譜實際指導意義更強。

探秘煙草基因組·煙草香型代謝組學分析研究

“小分子”蘊含“大能量”

煙葉烘烤過后呈現出的品質、香味差異，是否在鮮煙葉生長過程中就存在？同樣的品種“生淮南則為橘，生于淮北則為枳”，是否有基因層面的差別？這些問題，都將在煙草香型代謝組學分析研究中陸續得到解答。

代謝組學是上世紀90年代發展起來的一門新興學科，主要研究植物在代謝過程中產生或消耗的小分子物質，發現代謝規律，找到影響主要代謝物積累轉運的關鍵基因。

“作為煙草來說，煙支在燃燒過程中產生的煙氣，就是代謝物。”國家煙草基因研究中心煙草代謝組學研究室（以下簡稱“研究室”）學科帶頭人周會娜介紹說，就是這些小分子，使煙葉組織散發出香味。而煙草香型代謝組學研究，就是要弄明白煙草中所有香味物質的代謝規律，有效判斷和預測煙草香味物質的代謝變化，為培育不同香型的煙草品種服務。

說起來簡單，做起來著實不易。此前，行業很少有人接觸過代謝組學，研究的客觀條件不容樂觀。

2012年1月，研究室同中國科學院大連化學物理研究所開始了長期合作。該研究所是國內最早開展代謝組學研究的科研機構。通過項目合作和學習培訓，研究思路逐漸明確：

----以煙草香型、品質為研究切入點；

----對質譜檢測信號進行定性定量分析、對定性化合物進行基本規律分析；

----對全部質譜檢測信號進行基本規律分析和數據挖掘，全面了解煙草香味物質、有害成分的代謝基礎，建立煙草“指紋”圖譜，加快煙草品種選育和品質鑒定的科學化進程。

……

隨著項目的不斷推進，基因研究中心初步完成了行業代謝組學平臺的建設和第一批研究人才的培養。目前，研究團隊已有7名技術骨干，設備檢測能力基本完成對煙草代謝物的覆蓋，具備了系統進行煙草代謝組學研究的硬件條件。

“研究代謝產物，首先得找到它、分析它。”周會娜告訴記者，建立代謝組學測試分析方法是研究的關鍵。

自2011年研究啟動以來，研究團隊自主建立、優化了囊括煙草大部分初生和次生代謝產物的12項測試分析方法，積累了近1萬個樣本檢測數據，檢測到煙草代謝物總數2223種。煙葉代謝物檢測覆蓋度、精確度已處于國際領先地位。

通過分析典型品種不同生育時期中部葉位鮮煙葉代謝基礎數據，研究人員得出結論：生態環境對代謝組的影響大于遺傳因素；不同香型間代謝組存在明顯差異，總體來講，差異代謝物含量濃香型高于清香型、中間香型；濃香型煙葉生物堿和可溶性糖含量高于清香型、中間香型；部分代謝物在不同香型間的含量差異存在明顯的年度波動。

“研究結果表明，鮮煙葉中就存在決定煙葉香味品質的物質基礎。”周會娜介紹說，研究煙草關鍵化學成分合成、積累、轉運及變化的規律，解析影響煙草香型的關鍵代謝途徑和代謝網絡，找出其遺傳和生態成因，能夠為培育優質、低害的煙草新品種提供理論指導和技術支撐。

此外，研究團隊還在更深層次上發現了關鍵基因對于煙葉品質的作用----

二萜類物質與煙草香氣緊密相關，研究團隊克隆了該途徑4個關鍵基因，以主栽品種K326為材料，對其二萜類物質代謝途徑關鍵基因進行沉默或過表達，調控二萜類物質的代謝，研究代謝表型及其機理，煙草二萜類物質代謝途徑逐步打通，有望實現對煙草香氣物質的調控。

通過對甾醇代謝途徑的研究，發現了可以調控甾醇合成途徑的關鍵基因。初步研究結果表明，沉默這些基因表達，可以有效降低煙草甾醇含量。這一研究結果將有助于對煙氣中有害成分苯并芘的控制。

三年來，隨著煙草基因組計劃重大專項的實施，行業煙草代謝組學研究設施、團隊從無到有，實現了從跟隨到自主研究的思路轉變，今后將力爭讓“小分子”釋放“大能量”。

（文章來源：2014年7月23日《東方煙草報》：《探秘煙草基因組·功能基因組學研究》）