煙草在線據(jù)云南煙葉信息網(wǎng)報(bào)道　　云南煙草農(nóng)科院劉勇研究組根據(jù)煙草抗PVY的隱性基因，開發(fā)出一種新的與PVY抗性緊密連鎖的分子標(biāo)記CF2GR11，該標(biāo)記目前尚未見報(bào)道。該研究成果以“煙草PVY隱性抗病基因的分子標(biāo)記及其適用性”為題發(fā)表在2015年2月28日刊出的第1期《中國(guó)煙草學(xué)報(bào)》上。

　　煙草馬鈴薯Y病毒病，又稱為脈斑病，是由馬鈴薯Y病毒（PVY）引起的蚜傳病毒病，種植抗病品種是經(jīng)濟(jì)有效的防治措施。分子標(biāo)記輔助選擇可提高抗病育種效率。來源于X-射線誘變的Virgin A Mutante（VAM）的隱性抗PVY基因位點(diǎn)（va）被廣泛應(yīng)用于煙草抗病育種。大部分PVY抗源的抗性表現(xiàn)為隱性基因位點(diǎn)（va）控制，va基因型煙草植株的抗性是由于對(duì)PVY感病的基因片段的缺失造成。目前，與PVY抗性相關(guān)的分子標(biāo)記已有報(bào)道，但現(xiàn)有分子標(biāo)記RAPD、SCAR等與抗性的遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)。云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)已克隆了va基因位點(diǎn)的一個(gè)隱性抗PVY基因eIF4E-1（待發(fā)表），即感PVY基因。為了提高va位點(diǎn)的育種利用效率，研究組根據(jù)煙草隱性抗PVY基因（感病基因）eIF4E-1基因及其家族基因的序列信息，開發(fā)出一個(gè)新的與PVY抗性緊密連鎖的eIF4E-1基因特異分子標(biāo)記CF2GR1。

　　該研究組檢測(cè)了該標(biāo)記與抗性的遺傳距離，檢驗(yàn)了該標(biāo)記在部分品種和種質(zhì)資源中的適用性。CF2GR11在云煙87、紅花大金元和K326等感PVY品種可擴(kuò)增出500bp產(chǎn)物，在NC102、NC55和K326PVY等抗病品種無擴(kuò)增條帶。以抗、感PVY親本構(gòu)建的101個(gè)F2單株為定位群體遺傳連鎖分析表明，CF2GR11標(biāo)記與煙草PVY感病基因的遺傳距離為0.99cM。對(duì)46份PVY抗性明確的栽培煙草資源的檢測(cè)表明，供試資源的標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果與抗性的吻合度為100%，CF2GR11標(biāo)記適用性高。該基因標(biāo)記可用于抗PVY育種的輔助選擇和抗PVY資源的鑒定。

注：（1）NC102、NC55、K326PVY 抗PVY;K326、云煙87和紅花大金元感PVY，（2）陰性對(duì)照：水；（3）M：寶生物DL-2000 分子量標(biāo)準(zhǔn)；（4）A: CF2GR11 擴(kuò)增結(jié)果; B: 內(nèi)參基因Actin 擴(kuò)增結(jié)果。

圖1　引物CF2GR11在抗感品種間的多態(tài)性

圖2　基于CF2GR11標(biāo)記的Va基因位點(diǎn)的遺傳連鎖圖（cM）

　　前期研究證明，eIF4E-1缺失可賦予煙草對(duì)PVY的抗性。栽培煙草為異源四倍體，eIF4E-1的家族成員較多，序列相似率高。設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增與PVY抗性相關(guān)的eIF4E-1分子標(biāo)記難度較大。eIF4E-1的基因組大小約5.3kb。該研究通過在eIF4E-1基因的第1個(gè)外顯子內(nèi)設(shè)計(jì)上游引物，在內(nèi)含子區(qū)域設(shè)計(jì)下游引物，獲得在抗病品種中無擴(kuò)增條帶，而在感病品種中有特異條帶的引物對(duì)。

　　目前已有文獻(xiàn)獲得的與NC55PVY抗病對(duì)應(yīng)的等位基因Va連鎖標(biāo)記，均是通過抗性分離群體的大量差異標(biāo)記分型獲得的，標(biāo)記與抗性的連鎖距離相對(duì)較遠(yuǎn)。該研究根據(jù)煙草資源NC55等的隱性抗病基因的序列開發(fā)的分子標(biāo)記CF2GR11與抗性緊密連鎖，遺傳距離為0.99cM。

　　煙草抗PVY的抗源主要有兩大類：一類是以VAM為代表的隱性基因位點(diǎn)（va）控制的抗性，包括Perevi、Kerti No.1、PBD6、Wislica、NC744、NC745、TN86、TN90等種質(zhì)。另一類是以野生種N.africana為代表的對(duì)PVY免疫的抗性，包括N.africana的衍生種質(zhì)NC152、K326/Naf等。目前育種利用的抗源主要為va基因位點(diǎn)。VAM對(duì)PVYN的抗性由兩對(duì)隱性基因va1和va2控制，va1限制病毒細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)和阻斷病毒進(jìn)入維管束，va2抑制病毒細(xì)胞內(nèi)積累。利用該研究的CF2GR11可初步劃分煙草PVY抗性的類型。表型鑒定為抗PVY的資源，若CF2GR11標(biāo)記陰性，則表明該資源的PVY　抗性與eIF4E-1基因缺失有關(guān)，屬于隱性基因位點(diǎn)（va）控制的抗性；若F2GR11標(biāo)記陽(yáng)性，則表明該資源的PVY抗性與eIF4E-1基因缺失無關(guān)，屬于eIF4E-1基因突變或其他抗病機(jī)制。通過簡(jiǎn)單快速的標(biāo)記劃分抗性類型，有助于發(fā)現(xiàn)新的煙草PVY抗源。

　　栽培煙草的基因組約4.5G，具有巨大而且復(fù)雜等特點(diǎn)。根據(jù)少數(shù)品種驗(yàn)證的分子標(biāo)記，在多大范圍內(nèi)的種質(zhì)資源適用，需要實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。該研究結(jié)果表明，CF2GR11標(biāo)記在供試46個(gè)品種資源中都適用，包括常見va基因座的抗病資源與常見煙草品種。可利用該標(biāo)記輔助選擇eIF4E-1基因介導(dǎo)的PVY抗性。